사실 시험법을 검증하는 것이 직접 해보지 않고는 이해가 되지 않습니다만.. 가이드라인에 언급되는 내용을 읽어본다의 느낌으로 봐 주시면 좋을 것 같습니다.
1. 정확성(accuracy)의 정의
- 정확성(accuracy)은 측정된 결과 값이 일반적인 참값 또는 표준값에 근접한 정도를 의미하며, 시험 방법이 규정하는 모든 범위에서 증명되어야 합니다.
2. 정확성을 평가하기 위한 방법
- 정량시험
* 순도를 알고 있는 검체(e.g. 표준품)를 사용하여 검증하려는 시험방법(AMV)에 적용합니다.
* '정확성이 알려진 다른 시험방법에 의한 결과'와 '검증하려는 시험법(AMV)에 의한 결과'를 비교합니다.
* 만들어진 완제의약품성분의 혼합물(synthetic mixture)에 분석하려는 원료의약품(DS)의 알려진 양(known quantities)을 첨가하고, 이 검체를 사용하여 검증하려는 시험방법(AMV)에 적용합니다.
* 정밀성(precision), 직선성(linearity), 특이성(specificity)을 설정함으로써 추론할 수 있습니다.
- 불순물(정량시험)
* 알려진 양의 불순물이 첨가된 drug substance 또는 drug product를 정량함으로써 평가합니다.
* 특정 불순물 또는 분해생성물을 확보하는 것이 불가능한 경우 정확성이 알려진 기존의 시험방법에 의한 시험결과와 비교해도 됩니다.
- 정확성을 검증하기 위해 요구되는 데이터는 규정된 범위(specified range)를 포함하여 최소 3가지 종류의 농도에 대해 각 세 반복(총 9회)한 결과로부터 평가되어야 합니다.
* '알려진 양의 분석대상물질을 첨가한 검체를 정량'하는 경우는 회수율(%)로써 나타냅니다.
* '참값과 비교'하는 경우 평균값(mean)과 참값(accepted true value)으로 인증된 차이를 신뢰구간(confidence intervals)과 함께 보고되어야 합니다.
3. 실제 사례(design)
: 정확성(accuracy)과 특이성(specificity) 측면에서 특정 물질(검체)을 분석하기 위해 반드시 다루어야 할 문제는 무엇인가요?
☆ 간섭(interference), 특정 신호(signal)가 분석 대상 물질이라는 절대적인 확신이 없다면 적합 기준 (acceptance criteria)을 통과한 결과가 이미 검체에 존재하는 외부 신호일 수 있습니다. 이 때문에 시험법 검증 시 분석 대상 물질에 특이적임을 보장할 필요가 있습니다. 구조(structure) 또는 반응기(reactive group)에 의해 분석 대상 물질과 동일한 위치에서 동일한 신호를 생성할 수 있는 다른 물질을 구체적으로 다루어야 합니다. 신호가 관심있는 분석 대상 물질에 고유하다는 것이 증명되면 정확성을 신뢰할 수 있습니다. 이는 특히 불순물을 분석할 때 반복되는 문제입니다.
: Cell based 시험법에서 표준품은 특정 포물선을 생성할 때 미지의 검체(unknown sample)는 농도에 따라 왼쪽 또는 오른쪽으로 이동하는 유사한 곡선을 생성합니다. 최종 결과는 '표준 곡선에 대한 % relative'입니다. 특이성은 분석 대상 물질이 이 곡선을 생성한다는 것을 증명하였고, 분석 대상 물질 외에는 이 곡선을 생상하지 않습니다. 목표는 100%이며, 직선성은 50 ~ 150%의 범위에 포함되도록 설계되었습니다. 고려사항을 정의하고, 정확도(accuracy) 실험을 설계하시오.
☆ 고려사항
1) 분석 대상 물질만이 해당 곡선을 생성하므로 간섭(interference)은 고려 대상이 아닙니다.
- 검체의 농도에 따라 좌우로 이동만 하고, 유사한 곡선을 생성한다는 것은 특이성(specificity)이 검증되었다는 것을 의미
- 단, target 농도가 허용 범위 안에서 움직일 때 정확도(accuracy) 범위 안에 포함되어야 함
2) 정확도(accuracy)의 목적은 '이론적 matrix'를 만드는 것이며, 시험법을 고려할 때 어떤 요소를 조정해야 정확도에 영향을 주는지 파악해야 합니다
- 시험법의 반응(reaction) 확인
3) cell based 시험법이므로 세포의 성장(배양 시간)에 따른 농도를 고려해야 합니다
- 검체의 '일정한 농도 수준'을 유지하는 것이 중요
- 어떤 시점의 cell을 검체로 채취할 것인가?
- 전처리가 복잡할 수록 직선성(linearity)에 영향을 줌
4) 최종 결과는 '표준 곡선에 대한 %relative'
- 직선성에 포함되는 70 ~ 130%를 선정
☆ 정확도(accuracy) 실험 설계
1) 전제 조건
- 정확도 변동성이 최소 10% 낮도록 80 ~ 120%를 기준으로 검증
- 고유한 변동성을 야기하는 검체 처리(sample processing) 절차를 엄격하게 관리, 이 때 사용된 시약 등을 엄격하게 관리
- 연구개발부서의 시험법 검증을 그대로 수행하거나 받아들이는 것이 아닌 GMP site 내에서 조정 필요
2) 상기 작업 완료 후 '고유의 변동성 관리 절차'를 AMV 계획서나 SOP에 반영 후 아래와 같이 정확도 검증을 수행
- 최소 3명 이상의 시험자는 50%, 100%, 150%를 포함하는 검체를 시험의 복잡성에 따라 2일 또는 그 이상의 다른 날에 각 목표 %에서 3회 이상의 분석 수행
- 시험자간 변동성 평가, 특정 시험자의 반복 시험간 변동성 평가, 모든 개별적인 최종 결과의 변동성 평가
- 적합 기준은 시험자 간의 데이터 차이 또한 포함 필요
ICH Q2 내용과 사례를 반영하면서 작성하긴 했는데 어렵습니다. 아직 정밀성, 완건성, 직선성, 범위, 검출한계, 정량한계가 남아있습니다.
Reference: ICH Q2 Validation of analytical procedures